鯖魚(yú)生物胺產(chǎn)生菌篩選、菌落總數(shù)、生長(zhǎng)曲線測(cè)定——摘要、材料與方法
摘要：從鯖魚(yú)體內(nèi)分離7株生物胺產(chǎn)生菌，其中3株菌可以產(chǎn)生色胺，4株菌可以產(chǎn)生2-苯乙胺，4株菌可以產(chǎn)生腐胺，1株菌可以產(chǎn)生尸胺，3株菌可以產(chǎn)生組胺，1株菌可以產(chǎn)生酪胺。組胺生成量較高的No.1菌株形態(tài)學(xué)、生理生化分析及菌種鑒定結(jié)果表明該菌株極有可能為侵肺巴斯德氏菌，可信度為99.9%。
鯖魚(yú)又名青花魚(yú)，是一種常見(jiàn)的可食用魚(yú)類(lèi)，多見(jiàn)于西太平洋及大西洋海岸附近，喜群居。鯖魚(yú)平均體長(zhǎng)30～50 cm，壽命最長(zhǎng)可達(dá)11年，它以浮游生物及鱘魚(yú)、鱈魚(yú)和鯡魚(yú)所產(chǎn)魚(yú)卵為生，屬于青皮紅肉魚(yú)類(lèi)。近年來(lái)先后在江蘇及天津等地發(fā)現(xiàn)鯖魚(yú)生物胺中毒事件。
組胺是含咪唑環(huán)化合物，在附著在魚(yú)肉中的摩氏摩根氏菌，磷發(fā)光桿菌等微生物來(lái)源的組氨酸脫羧酶（histidine decarboxylase，HDC）的作用下，使組氨酸脫去羧基而產(chǎn)生組胺。游離氨基酸是生物胺產(chǎn)生的前體物質(zhì)，水產(chǎn)品中游離氨基酸的量和種類(lèi)對(duì)氨基酸脫羧酶的活力都會(huì)產(chǎn)生影響。其中組胺是引起過(guò)敏性食物中毒的最主要化學(xué)物質(zhì)，是人們對(duì)海水魚(yú)類(lèi)安全問(wèn)題關(guān)注的熱點(diǎn)。
生物胺產(chǎn)生菌普遍存在于海水魚(yú)的體表及活魚(yú)的鰓和內(nèi)臟中，在魚(yú)體存活時(shí)對(duì)魚(yú)體并不產(chǎn)生危害。魚(yú)體一旦死亡，隨著防御系統(tǒng)被破壞，生物胺產(chǎn)生菌在適宜溫度下迅速繁殖并產(chǎn)生大量組胺?；邗涺~(yú)頻繁引起生物胺特別是組胺中毒現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究篩選生物胺產(chǎn)生菌，對(duì)分離菌的形態(tài)特征、生物胺生成情況進(jìn)行分析，為鯖魚(yú)貯藏過(guò)程中生物胺的形成及控制提供參考依據(jù)。
1、材料與方法
1.1材料、試劑與設(shè)備
1.1.1材料
冰鮮鯖魚(yú)購(gòu)于廣州市海珠區(qū)下渡路水產(chǎn)市場(chǎng)，經(jīng)去頭、去內(nèi)臟、無(wú)菌包裝后于室溫下（18～23℃）存放備用。
1.1.2試劑
生物胺標(biāo)準(zhǔn)品：組胺（h i s t a m i n e，H I S）（≥97%）、色胺（tryptamine，TRP）（≥98%）、2-苯乙胺（2-phenethylamine，2-PHE）（≥99.5%）、尸胺（cadaverine，CAD）（≥97%）、腐胺（putrescine，PUT）（≥99%）、亞精胺（spermidine，SPM）（≥98%）、精胺（spermine，SPD）（≥97%）、酪胺（tyramine，TYR）（≥99%）、丹磺酰氯（99%）、1,7-二氨基庚烷（98%）美國(guó)Sigma公司；乙腈、甲醇、丙酮均為色譜純美國(guó)Burdick&Jackson公司；其他試劑均為化學(xué)純或分析純，購(gòu)于廣州粵申化學(xué)試劑廠。
1.1.3培養(yǎng)基
PCA培養(yǎng)基（1 L）：準(zhǔn)確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15 g，加入1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值至7.0±0.2。
生物胺篩選培養(yǎng)基（1 L）：準(zhǔn)確稱取蛋白胨5.0 g、酵母浸粉5.0 g、L-組氨酸18.5 g、氯化鈉5.0 g、碳酸鈣1.0 g、瓊脂20 g和溴甲酚紫0.06 g，使用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至5.3±0.2。
TSA培養(yǎng)基（1 L）：稱取47 g干粉于1 L蒸餾水中加熱煮沸溶解，滅菌后制成平板備用。
TSBH培養(yǎng)基（1 L）：準(zhǔn)確稱取TSB培養(yǎng)基38 g和L-組氨酸20 g，加入1 L蒸餾水，煮勻，滅菌后使用；以上培養(yǎng)基于1.01×105Pa高壓下121℃蒸汽滅菌15 min。
1.1.4儀器與設(shè)備
TU-1990紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；3K30型冷凍離心機(jī)美國(guó)Sigma公司；388型立式蒸汽壓力滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；Agilent 1100高效液相色譜儀美國(guó)Agilent公司；WGP-350隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱上海華巖儀器設(shè)備有限公司。
1.2方法
1.2.1菌落總數(shù)的測(cè)定
參考盧涵等的方法測(cè)定菌落總數(shù)。取常溫貯藏0、1、2、3、4、5 d的鯖魚(yú)背部肌肉組織，無(wú)菌條件下?lián)v碎混勻，稱取10 g置于裝有90 mL生理鹽水的錐形瓶中（內(nèi)含滅菌玻璃珠），混勻。用無(wú)菌生理鹽水依次稀釋成10倍系列稀釋樣品勻液，無(wú)菌條件下進(jìn)行PCA培養(yǎng)基平板稀釋實(shí)驗(yàn)。
1.2.2菌株的分離與純化
參考楊健等的方法，將上述樣品稀釋液在無(wú)菌條件下在生物胺篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布實(shí)驗(yàn)，然后將涂布后的培養(yǎng)基置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，肉眼觀察生物胺篩選培養(yǎng)基上的菌落，藍(lán)紫色菌落即為生物胺產(chǎn)生菌。用接種環(huán)將培養(yǎng)基中的藍(lán)紫色菌落接種于TSA培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，35℃培養(yǎng)2 d。
1.2.3菌株生長(zhǎng)狀況及生物胺生成情況
將純化后的細(xì)菌接種于TSBH培養(yǎng)基中，分別置于4℃和35℃環(huán)境中振蕩培養(yǎng)2 d，用紫外分光光度計(jì)連續(xù)測(cè)定培養(yǎng)液的OD605 nm值，表示各細(xì)菌的生物量。參考楊賢慶等的方法，取1 mL 35℃條件下培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液，采用柱前衍生高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對(duì)組胺（HIS）、色胺（TRP）、2-苯乙胺（2-PHE）、腐胺（PUT）、尸胺（CAD）、酪胺（TYR）、亞精胺（SPD）和精胺（SPM）8種生物胺進(jìn)行測(cè)定分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
色譜測(cè)定參數(shù)：色譜柱：Grace Smart RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），柱溫40℃，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10μL，熒光激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm。流動(dòng)相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相C為超純水。梯度洗脫程序見(jiàn)表1。
表1梯度洗脫程序表
1.2.4生化實(shí)驗(yàn)
1.2.4.1菌落形態(tài)及色澤觀察
觀察并描述單菌落在平板上的形狀、大小、邊緣、表面、隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基的顏色等菌落特征。
1.2.4.2革蘭氏染色
挑取菌落，進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，用顯微鏡觀察菌體的革蘭氏染色情況。
1.2.4.3菌種鑒定
挑取單菌落分別接種于3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.45%無(wú)菌NaCl溶液（pH 4.5～7.0）中，混勻，配制相當(dāng)于0.80～0.10麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，使用丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。
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