Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的毒性作用（二）
1.2.4急性毒性實(shí)驗(yàn)
在超凈無(wú)菌工作臺(tái)內(nèi)將-20℃保存的Vibrio fisch?eri凍干粉西林瓶打開(kāi)，取復(fù)蘇液1 mL于室溫下平衡復(fù)蘇10 min，振蕩搖勻。吸取發(fā)光菌液1 mL，用2%NaCl稀釋至40 mL。將不同濃度樣品（Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白和復(fù)合體系）溶液放在96孔板中，不同物質(zhì)每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行，第一行設(shè)置為陰性質(zhì)控（2%NaCl），為初始發(fā)光強(qiáng)度，第二行為陽(yáng)性質(zhì)控（10 mg?L-1的ZnSO4溶液），為樣品發(fā)光強(qiáng)度。各孔中加入樣品液180μL和發(fā)光菌液20μL，總體積200μL，15 min后放入檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。根據(jù)Vibrio fischeri的熒光強(qiáng)度計(jì)算抑制率（RI，%），計(jì)算公式如下：
R1=(C0-St)/C0*100%
式中：C0為陰性質(zhì)控初始發(fā)光強(qiáng)度；St為t時(shí)樣品的發(fā)光強(qiáng)度。
1.3數(shù)據(jù)處理
每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用SPSS 22進(jìn)行分析，采用單因素方差分析（ANOVA）和最小顯著性差異（LSD）檢驗(yàn)差異的顯著性，采用Origin 9繪圖。
2結(jié)果與討論
2.1不同濃度Zn2+、Cd2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
重金屬對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生抑制作用，濃度愈高抑制作用愈強(qiáng)。Zn2+、Cd2+濃度增加對(duì)B.subtilis和E.coli的抑制增強(qiáng)（圖1），E.coli細(xì)胞壁具有帶負(fù)電荷的脂多糖，其可與更多的金屬陽(yáng)離子結(jié)合，B.subtilis耐性強(qiáng)于E.coli。不同金屬對(duì)生物體的毒性不同，Cd2+對(duì)B.subtilis和E.coli生長(zhǎng)的抑制作用大于Zn2+。Cd是強(qiáng)毒性元素，低濃度就有很強(qiáng)的毒性；Zn是生物體必需元素，低濃度Zn可保護(hù)細(xì)胞免受傷害。Zn2+和Cd2+的加入均對(duì)兩種細(xì)菌產(chǎn)生了不同程度的毒害，如圖1所示，Cd2+對(duì)兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制效果強(qiáng)于Zn2+。不同濃度的Zn2+和Cd2+脅迫培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)0~24 h時(shí)，OD值均低于對(duì)照組。隨著金屬濃度的增加，0~11 h為B.subtilis的生長(zhǎng)期，此時(shí)生長(zhǎng)曲線呈快速生長(zhǎng)趨勢(shì)，吸光值增大，12~15 h處于穩(wěn)定期，15 h以后OD值減弱，此時(shí)為衰亡期。Zn2+和Cd2+濃度分別在20μg?mL-1和8μg?mL-1時(shí)完全抑制E.coli生長(zhǎng)。
圖1不同濃度Zn2+、Cd2+對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
2.2 Cry1Ac蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的影響
圖2為Cry1Ac蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露條件下的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。
在0~16 h，各處理組細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的OD600值均低于對(duì)照組。在0~10 h內(nèi)細(xì)菌處于生長(zhǎng)期，Cry1Ac蛋白和Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac聯(lián)合暴露對(duì)B.subtilis和E.coli生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制，且隨濃度增加細(xì)菌生長(zhǎng)受到的抑制作用增強(qiáng)，且E.coli比B.subtilis更為敏感。Cd2+單獨(dú)及復(fù)合體系對(duì)兩種細(xì)菌的毒性明顯強(qiáng)于Zn2+單獨(dú)及其復(fù)合體系，Zn在短期內(nèi)的毒性可能與生物體內(nèi)貯存濃度有關(guān)，當(dāng)Zn在生物體內(nèi)積累到一定濃度就會(huì)啟動(dòng)金屬硫蛋白，促使其與金屬硫蛋白結(jié)合而降低毒性。同時(shí)Zn2+和Cd2+都會(huì)與Cry1Ac蛋白結(jié)合，從而減輕重金屬對(duì)細(xì)菌的毒害。
2.3 Cry1Ac蛋白及其與Zn2+、Cd2+聯(lián)合暴露下菌落平板生長(zhǎng)狀況觀察
采用平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)Zn2+、Cd2+及Cry1Ac蛋白聯(lián)合暴露時(shí)對(duì)E.coli和B.subtilis存活的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著重金屬濃度的增加，細(xì)菌的存活率顯著降低（P<0.05）。重金屬會(huì)抑制細(xì)菌酶活性及其生長(zhǎng)，高濃度重金屬甚至?xí)?dǎo)致細(xì)菌死亡。Cd2+濃度為10μg?mL-1時(shí)E.coli和B.subtilis的存活率均為0，表明Cd2+濃度為10μg?mL-1時(shí)對(duì)兩種細(xì)菌的抑制率達(dá)到最大。當(dāng)Zn2+濃度為16μg?mL-1時(shí)，E.coli的存活率為0，Zn2+濃度為20μg?mL-1時(shí)，B.subtilis的存活率為0，表明Zn2+濃度為16、20μg?mL-1時(shí)分別對(duì)兩種細(xì)菌抑制率達(dá)到最大。當(dāng)Zn2+-Cry1Ac的濃度為4μg?mL-1時(shí)，對(duì)E.coli和B.subtilis的存活率分別為74.7%和76.8%，當(dāng)Cd2+-Cry1Ac濃度為4μg?mL-1時(shí)，E.coli和B.subtilis的存活率分別為66.1%和71.2%，即Cd2+-Cry1Ac對(duì)兩種細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效果強(qiáng)于Zn2+-Cry1Ac。
圖3不同濃度Zn2+、Cd2+及其與Cry1Ac蛋白聯(lián)合處理的細(xì)菌存活菌落電鏡圖
相關(guān)新聞推薦
1、352株盆腔炎支原體對(duì)12種抗生素藥物敏感性試驗(yàn)分析
2、多抗噬菌體菌株大腸桿菌E.coli PRE12在LB培養(yǎng)基和TB培養(yǎng)基下的生長(zhǎng)曲線圖
3、塔克拉瑪干沙漠微生物群落結(jié)構(gòu)和微生物多樣性
4、忍冬提取液對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞形態(tài)和生物膜形成能力的影響（一）