白色念珠菌快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒檢驗原理、方法及效果評估
念珠菌性陰道炎系念珠菌侵犯外陰和(或)陰道淺表上皮細胞所致的炎癥過程，表現(xiàn)為外陰瘙癢和陰道分泌物異常的感染性疾病。念珠菌性陰道炎是婦女從青春期到絕經(jīng)期前、后最常見的一種陰道炎，病原菌以白色念珠菌為多見。近年來，隨著真菌感染不斷增多以及抗真菌藥的廣泛應用，真菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重?！犊咕幬锱R床應用指導原則》明確指出，念珠菌性陰道炎必須進行細菌培養(yǎng)，獲得病原菌后進行藥敏試驗，根據(jù)不同病原體選擇抗菌藥物。常規(guī)的細菌培養(yǎng)和藥敏試驗一般需要2～3 d，加上門診患者對治療的急切需求，經(jīng)驗治療與藥敏試驗的滯后易造成病情的延長與反復。因此，快速、準確地從標本中檢出病原菌，盡早獲得藥敏試驗結(jié)果，對于疾病的早期診斷和治療有著十分重要的意義。本研究采用白色念珠菌快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒，對門診念珠菌性陰道炎患者的陰道分泌物進行鑒定和直接藥敏試驗，現(xiàn)報告如下。
1材料與方法
1.1菌株來源
選取2013年9月—2014年8月陰道分泌物常規(guī)檢測中找到念珠菌的門診患者，共205例，年齡19～41歲。由婦科醫(yī)師取無菌棉拭子經(jīng)窺陰器進入陰道，取后穹窿或陰道上端分泌物置于無菌管中。
1.2儀器與試藥
生化培養(yǎng)箱LRH-250A(廣東省醫(yī)療器械廠);白色念珠菌快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒(第四軍醫(yī)大學研制，陜西百盛園生物科技信息有限公司生產(chǎn))。試劑盒檢驗原理:白色念珠菌利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分進行增殖，分解糖類，產(chǎn)生氫離子，使培養(yǎng)基的pH值降低，使培養(yǎng)基中的指示劑由原來的綠色轉(zhuǎn)變成黃色;藥敏板中有9種抗真菌藥，利用這9種抗真菌藥高、低濃度在體外對微生物生長的抑制作用，對微生物進行耐藥性分析。
1.3方法
按白色念珠菌快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒說明書的要求操作。采集標本后的棉拭子用1.5 ml無菌0.9%氯化鈉注射液充分稀釋，取50μl稀釋液加入配好的培養(yǎng)基溶液內(nèi)，混勻后各取50μl加入藥敏板孔中，蓋上藥敏板蓋。將剩余的培養(yǎng)基連同藥敏板一起置于35℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察結(jié)果。按白色念珠菌快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒說明書來判斷試驗的有效性及藥敏試驗結(jié)果。
2結(jié)果
205例念珠菌性陰道炎患者的陰道分泌物中，共173例檢出白色念珠菌，檢出陽性率為84.39%。173株白色念珠菌快速藥敏試驗結(jié)果顯示，克霉唑的敏感性最高，其次分別為氟康唑、酮康唑;制霉菌素的耐藥率超過50%，見表1。
表1 173株白色念珠菌快速藥敏試驗結(jié)果［例(%)］
3討論
念珠菌性陰道炎的復發(fā)率較高，藥物的不規(guī)范治療是造成耐藥菌株增多的主要原因之一。經(jīng)驗治療易造成病原菌的逃逸、增加疾病的復發(fā)率及耐藥菌的出現(xiàn)。大多數(shù)念珠菌性陰道炎根據(jù)顯微鏡檢查可診斷，最可靠的方法是進行細菌培養(yǎng)。念珠菌的種屬為最重要的因素，其決定了抗真菌治療的效果，對于嚴重與復發(fā)陰道炎的治療非常重要。病原體培養(yǎng)和藥物敏感性測定可以最終確定病原微生物以及提供有效的用藥指導。
常規(guī)病原菌培養(yǎng)及藥敏試驗耗時較長，且常規(guī)的ATB Fungus 3真菌藥敏試劑盒中只有兩性霉素B、氟胞嘧啶、伊曲康唑、氟康唑與伏立康唑等5種抗真菌藥，不能對目前臨床上常用的栓劑如咪唑類的克霉唑、咪康唑、酮康唑及多烯類的制霉菌素進行藥敏試驗。本研究采用快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒檢測陰道白色念珠菌，試驗結(jié)果通過顏色的變化來判斷，比常用的紙片擴散法測量抑菌圈的操作更簡便，檢出陽性率為84.39%，與報道的常規(guī)培養(yǎng)法的檢出有效率相近。
快速鑒定培養(yǎng)藥敏試劑盒僅需24 h，培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗即一步完成，就診次日即可獲得試驗結(jié)果，比常規(guī)試驗至少提前48 h，減少了經(jīng)驗用藥的盲目性，提高了藥物治療水平;此外，對臨床常用的9種抗真菌藥均進行藥敏試驗，增加了選藥的依據(jù)。試驗操作過程中發(fā)現(xiàn)，試驗結(jié)果的準確性與菌液濃度及培養(yǎng)時間密切相關。菌液濃度過高會造成藥敏試驗假耐藥結(jié)果，濃度過低會造成鑒定試驗假陰性或藥敏試驗假敏感結(jié)果;試驗盒操作規(guī)程未對菌液濃度作詳細說明，且原始標本的濃度差異較大。本試驗用比濁儀將菌懸液調(diào)為2麥氏濁度，試驗結(jié)果的重現(xiàn)性較好。為保證菌落有足夠的繁殖時間，標本在培養(yǎng)箱中至少放置24 h，但不宜超過72 h，時間過長易造成藥敏試驗假耐藥結(jié)果。據(jù)文獻報道，白色念珠菌在陰道中的耐藥性因不同時間、不同地區(qū)而有較大差異。
本次試驗檢測出的白色念珠菌對9種抗真菌藥呈現(xiàn)不同程度的敏感性，與各地區(qū)的報道不盡一致。試驗結(jié)果顯示，克霉唑?qū)Π咨钪榫拿舾行宰罡?93.06%)，其次分別為氟康唑(79.19%)、酮康唑(71.10%);伊曲康唑、氟胞嘧啶及咪康唑的耐藥率超過40%，應慎重經(jīng)驗用藥;制霉菌素的耐藥率超過75%，應暫停臨床應用，追蹤耐藥監(jiān)測結(jié)果。根據(jù)流行情況、臨床表現(xiàn)、微生物學、宿主情況，念珠菌性陰道炎可分為單純性和復雜性，90%的初發(fā)患者為單純性。
對于單純性念珠菌性陰道炎，相關指南推薦短期口服或局部治療，局部治療可選用克霉唑、咪康唑或制霉菌素，其療效相仿，口服可選氟康唑或伊曲康唑。結(jié)合本試驗結(jié)果，作為經(jīng)驗治療，可首選克霉唑局部用藥或口服氟康唑。復雜性念珠菌性陰道炎相對少見，據(jù)報道，約92%復雜性念珠菌性陰道炎患者的病原體仍為白色念珠菌。復雜性念珠菌性陰道炎的治療難度大，病原學結(jié)果對診療至關重要，病原體需考慮是否為白色念珠菌的耐藥株或不敏感株，或者為對氟康唑天然不敏感的非白色念珠菌(如克柔念珠菌或光滑念珠菌)。對于上述氟康唑治療無效的菌株，相關指南建議使用伊曲康唑。文獻報道，伊曲康唑治療念珠菌性陰道炎，顯著療效、不良反應發(fā)生率較低、給藥方便且療程較短。但本試驗結(jié)果顯示，伊曲康唑?qū)Π咨钪榫拿舾行詢H為27.74%。由此可見，應結(jié)合藥敏結(jié)果選用藥物。
真菌感染是一個復雜的過程，影響抗真菌藥療效的因素很多，如藥物在感染局部組織中達到的濃度等;同時，體外藥敏試驗結(jié)果與療效之間只能是在一定程度上相關。需注意的是，對于無癥狀、體征的患者，念珠菌培養(yǎng)陽性并不是治療的指征。念珠菌性陰道炎的癥狀和損害通常在有效治療48～72 h后緩解，但真菌學檢查陰轉(zhuǎn)通常在治療后4～7 d，而抗念珠菌的初步治療應持續(xù)至患者的癥狀消失及念珠菌培養(yǎng)陰性。因此，及時、準確的病原學結(jié)果，對實際抗真菌治療的療程有一定的指導意義。
綜上所述，相比于常規(guī)的試驗方法，快速試驗法操作簡單、標本易獲取、試驗耗時短，對病原菌的及早判斷與制訂正確的治療方案有著重要意義，有利于臨床準確用藥，值得推廣。但該試驗方法尚處于起步階段，距離成為一種標準化的試驗方法還有相當差距，仍需大量的研究工作來完善。隨著耐藥菌株的不斷增加，對臨床分離的致病念珠菌進行耐藥性監(jiān)測并正確、合理選擇抗真菌藥非常重要。念珠菌性陰道炎的治療目的是消除癥狀，防止復發(fā)，盡可能減少治療的不良反應。應綜合考慮病原菌、患者個體差異和抗真菌藥的藥動學/藥效學特點，給予優(yōu)化治療。