平湖紅曲黃酒釀造過程中真菌菌群動態(tài)、紅曲霉生長抑制因素（一）
紅曲黃酒是中國黃酒的典型代表，因添加了紅曲釀造，增加了酒體中的活性組分而備受推崇。紅曲霉是紅曲的優(yōu)勢菌，在紅曲黃酒的釀造過程中發(fā)揮著重要作用。其一，紅曲霉作為紅曲黃酒釀造體系中的主要產(chǎn)色菌，其發(fā)酵產(chǎn)生的紅曲色素（包括黃色素、橙色素、紅色素3大類）可以賦予紅曲黃酒特征的外觀顏色；其二，紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物（紅曲色素、莫納克林K、γ-氨基丁酸、麥角固醇等）豐富了酒體的活性成分，增加了紅曲黃酒的保健功能；其三，紅曲霉強大的酶系能夠催化底物生成醇類、酯類、有機酸等風味物質(zhì)，豐富了酒體的口感和芳香。
由于紅曲霉對紅曲黃酒的色、香、味及保健功能等品質(zhì)做出了較為突出的貢獻，因此探明傳統(tǒng)釀造過程中紅曲霉的動態(tài)變化和生長機制尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)紅曲霉在紅曲黃酒傳統(tǒng)釀造過程中的菌量呈不斷下降的趨勢，對其原因并未深入探究。針對紅曲霉生長的抑制因素，除了營養(yǎng)物質(zhì)的消耗之外，其它微生物的生長代謝也可能會對紅曲霉的生長產(chǎn)生影響。通過變性凝膠電泳技術(shù)揭示了紅曲黃酒釀造過程中的優(yōu)勢細菌為乳桿菌，發(fā)酵液酸度的增加可能會抑制紅曲霉的生長；通過宏基因組學技術(shù)對海派黃酒釀造過程中真菌菌群動態(tài)進行跟蹤測定，試驗結(jié)果表明曲霉屬的相對豐度隨釀造時間的延長有所下降，并指出影響其變化的原因可能與酸度、酒精度的增加有關(guān)。有學者表明，紅曲黃酒釀造過程中pH值的變化在3.5～5.5范圍內(nèi)，此酸度適宜紅曲霉的生長繁殖，且適宜濃度的酸、醇能夠促進高溫型紅曲霉的生長。此外，釀造過程中的其它因素亦可能對紅曲霉產(chǎn)生影響，這使得紅曲霉與其生長抑制因素之間的關(guān)系變得復雜。
為探明紅曲黃酒釀造過程中紅曲霉的主要抑制因素，本研究將采用分子生態(tài)學PCR-DGGE技術(shù)及實時熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，對平湖紅曲黃酒釀造過程中的真菌菌群動態(tài)進行定性、定量分析，并根據(jù)紅曲霉菌量不斷減少的趨勢推測其中可能的原因，同時構(gòu)造相應的體系進行驗證，尋找影響紅曲霉生長的關(guān)鍵因子，為探究紅曲霉在發(fā)酵過程中的作用機制以及改善紅曲黃酒的品質(zhì)提供依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料與試劑
平湖紅曲（Q01），福建省古田縣平湖紅酒曲有限公司；紅曲霉C1，由平湖紅曲中分離純化而得，編號C1，由福州大學食品科學技術(shù)研究所保藏。圓糯米，福州市閩侯縣上街鎮(zhèn)糧油站；真菌基因組提取所需試劑、引物、PCR試劑盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它試劑均為分析純級。
糯米培養(yǎng)基：用于液化液的制備；糯米和水按質(zhì)量比1∶1.5的比例混合，在室溫下浸泡8 h，121℃蒸煮20 min。
1.2儀器與設(shè)備
SW-CJ-IFD型超凈工作臺，上海博訊實業(yè)；GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏；BIO-RAD DcodeTM型梯度變性凝膠電泳，美國伯樂公司；瓊脂糖水平板電泳儀，北京六一公司；JS-380C型凝膠成像分析儀，上海培清；7890A氣相色譜儀，安捷倫。
1.3試驗方法
1.3.1平湖紅曲黃酒釀造及取樣過程將糯米浸泡蒸熟攤涼后，與研磨浸泡后的平湖紅曲（Q01）攪拌均勻，放入滅菌后的酒壇中，25℃糖化5 d，再調(diào)整溫度為18℃，密封發(fā)酵25 d。紅曲與糯米按質(zhì)量比1∶10添加，糯米與水添加比例為質(zhì)量比1∶1.5。取樣時間點設(shè)置為發(fā)酵前期（第1～7天）、中期（第10天）、后期（第20、30天）。
1.3.2發(fā)酵樣品預處理發(fā)酵樣品攪拌均勻后，取2.00 g，稱于20 mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻后分裝于2 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，棄上清后，沉淀放置-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?
1.3.3孢子懸浮液的制備紅曲霉C1活化結(jié)束后，用孢子洗脫液洗下孢子，轉(zhuǎn)入帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩，充分打散孢子，用4層無菌擦鏡紙過濾去除菌絲，利用血球計數(shù)板在光學顯微鏡下計數(shù)，制成終濃度為106個/mL的均一孢子懸液，備用。
1.3.4各體系紅曲霉菌量變化的跟蹤方法樣品真菌基因組DNA的提取及實時熒光定量PCR分析。
1.3.5發(fā)酵體系的構(gòu)建模擬傳統(tǒng)：30 g蒸熟糯米、3 g紅曲和45 mL無菌水，三者的質(zhì)量比與酒壇釀造一致。
純菌發(fā)酵：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。
體系1（除去曲米）：30 g蒸熟糯米、紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液加入），補水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。
體系2（抑制因子）：30 g蒸熟糯米、無菌的紅曲處理上清液（3 g紅曲研磨后加生理鹽水充分振蕩，靜置分層，取上清液用0.22μm的無菌濾膜過濾）、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液，補水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積。
體系3（不同酒精度）：30 g蒸熟糯米、3 mL純菌紅曲霉（C1）菌液、不同體積的乙醇，補水至與模擬傳統(tǒng)體系同體積，最終乙醇的體積分數(shù)分別為0，4%，13%，16%，25%，50%。
以上均在100 mL的錐形瓶中30℃下培養(yǎng)。
1.3.6酒精度的測定采用填充柱氣相色譜法。
（1）色譜條件
色譜柱：10%PEG填充柱；載氣：N2；進樣量：1μL；空氣流速：0.2 MPa；H2流速：0.05 MPa；載氣流速：0.3 MPa；氣化室溫度：230℃；柱溫：80℃；檢測器溫度：250℃。
（2）標曲的繪制
吸取無水乙醇配制成質(zhì)量濃度分別為0，1.0000，1.5000，2.0000，2.5000，3.0000，4.0000 g/L的乙醇工作液，同時配制2.0000 g/L的正丙醇標準液，分別將各質(zhì)量濃度的乙醇工作液與正丙醇標準液等體積混合后進樣，每個樣品重復2次，得到各質(zhì)量濃度的乙醇工作液與正丙醇標準液的峰面積比Ai/As，以標樣的峰面積比值的平均值為橫坐標，乙醇的質(zhì)量濃度為縱坐標，繪制標準曲線。
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