全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀操作方法及實(shí)驗(yàn)步驟【應(yīng)用實(shí)例】
菌落是細(xì)菌或霉菌在一定溫度、時(shí)間、濕度條件下，于營養(yǎng)物質(zhì)中生長繁殖而形成的能夠被我們所識(shí)別的生長物，形成以母細(xì)胞為中心的一團(tuán)肉眼可見的，有一定形態(tài)、構(gòu)造等特征的子細(xì)胞集落。菌落總數(shù)是指在一定條件下（培養(yǎng)時(shí)間、適宜溫度、pH值等）每克/毫升被測樣品所生長出來的菌落的總體數(shù)量。在紡織品微生物的檢測過程中常常會(huì)存在菌落計(jì)數(shù)問題，若平皿上的菌落數(shù)較少時(shí)可肉眼直接觀察計(jì)數(shù)，但在高污染樣品的檢測或者抗菌性試驗(yàn)過程中，平皿上的菌落數(shù)較多，幾十個(gè)甚至幾百個(gè)，這種情況下要完成大批量檢驗(yàn)檢疫時(shí)肉眼觀察菌落數(shù)存在耗時(shí)嚴(yán)重、眼睛易疲勞。另外，僅留下一個(gè)統(tǒng)計(jì)數(shù)字，原始數(shù)據(jù)結(jié)果無法保存，缺乏后期的數(shù)據(jù)分析，不利于實(shí)現(xiàn)檢測的準(zhǔn)確性及數(shù)據(jù)化管理。
本試驗(yàn)選擇自主合作研發(fā)的全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，對平皿上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，與人工肉眼計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行比較，以驗(yàn)證全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀的準(zhǔn)確性、精密度和重現(xiàn)性，從而確定該全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀是否符合菌落計(jì)數(shù)要求，能否應(yīng)用于紡織產(chǎn)品中微生物的檢測計(jì)數(shù)。
1、材料與方法
1.1試劑與材料
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、沙氏瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，購于北京陸橋技術(shù)股份有限公司。
普通一次性使用口罩（非滅菌型）、醫(yī)用口罩（滅菌型）的試驗(yàn)樣品均來源于市售。
1.2儀器與設(shè)備
全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（丹麥BioSense公司）、生物安全柜（ESCO AC2-6SI）、生化培養(yǎng)箱（賽默飛RI-250）、霉菌培養(yǎng)箱（賽默飛RI-150）、立式壓力蒸汽滅菌器（雅馬拓SQ510C）。
1.3標(biāo)準(zhǔn)菌株
細(xì)菌：大腸桿菌ATCC 8099、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、枯草芽孢桿菌ATCC 6633，購于廣東省微生物研究所。試驗(yàn)前按照說明書對所涉及的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行活化。
1.4試驗(yàn)方法
1.4.1菌懸液的制備
采用二步預(yù)培養(yǎng)程序制備每種細(xì)菌的接種菌懸液。從第3代菌種的試管斜面中取一環(huán)在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上畫線，在（37±1）℃下培養(yǎng)（22±2）h，然后在三角瓶中添加20mL營養(yǎng)肉湯，用接種環(huán)從已培養(yǎng)的平皿中挑一個(gè)典型的菌落，接種到營養(yǎng)肉湯中，在（37±1）℃下130r/min振蕩培養(yǎng)（19±1）h，即制得接種菌懸液，采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整活菌數(shù)的濃度，活菌數(shù)應(yīng)達(dá)到1×102CFU/mL～5×102CFU/mL，經(jīng)稀釋法測定活菌數(shù)的濃度。
1.4.2準(zhǔn)確性試驗(yàn)
試驗(yàn)選用一次性平皿的傾注法進(jìn)行驗(yàn)證，以檢測細(xì)菌菌落總數(shù)和真菌菌落總數(shù)。隨機(jī)選取不同批次的普通一次性使用口罩（非滅菌型）至少3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣剪碎、稱取（10±1）g樣品，加入200mL滅菌生理鹽水，充分混勻后得到一個(gè)生理鹽水樣液。自然沉降后取上清液做菌落計(jì)數(shù)，共接種10個(gè)平皿，每個(gè)平皿中加入1mL樣液，其中5個(gè)平皿倒入45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL～20mL，混勻凝固后，置（35±2）℃培養(yǎng)48h；另外5個(gè)平皿倒入45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基15 mL～20mL，混勻凝固后，置（25±2）℃培養(yǎng)5～7天，檢測結(jié)果分別用目測法和儀器法進(jìn)行計(jì)數(shù)，分析兩種計(jì)數(shù)結(jié)果的方法是否存在顯著性差異。
1.4.3精密度試驗(yàn)
隨機(jī)選取10個(gè)不同批次的醫(yī)用口罩（滅菌型），每個(gè)樣品稱取（0.4±0.05）g，折疊成邊長為18mm的正方形，接種0.2mL上述濃度的菌懸液（大腸桿菌:金黃色葡萄球菌:枯草芽孢桿菌=1:1:1）后，立即向瓶內(nèi)加入20mL冰冷生理鹽水，振蕩器振蕩（5s、5次），洗脫試樣上的活菌，用10倍稀釋法稀釋洗脫液，測定試樣上的活菌數(shù)，不接種菌懸液的樣品做空白對照，每個(gè)樣品做7組平行試驗(yàn)，采用儀器法進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。
1.4.4重現(xiàn)性試驗(yàn)
同一個(gè)平皿采用兩種計(jì)數(shù)結(jié)果的方法，不同人員分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來評價(jià)兩種計(jì)數(shù)方法的重現(xiàn)性，并計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。
1.4.5數(shù)據(jù)分析
結(jié)果準(zhǔn)確性采用minitab軟件進(jìn)行配對T檢測分析，儀器法的精密度試驗(yàn)結(jié)果偏差應(yīng)小于10%，重現(xiàn)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于10%。
3、結(jié)果與分析
3.1準(zhǔn)確性試驗(yàn)
采用一次性平皿傾注法對隨機(jī)選取的20個(gè)批次普通一次性使用口罩（非滅菌型）進(jìn)行菌落總數(shù)測定，分別采用目測法和儀器法對測試結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)，見表1。
表1兩種計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證
目測法與儀器法所得的細(xì)菌菌落總數(shù)結(jié)果RSD小于10%的符合率為90%，所得的真菌菌落總數(shù)結(jié)果RSD小于10%的符合率為85%，可知平板菌落數(shù)采用目測法和儀器法檢測的偏差不大。另外，當(dāng)菌落數(shù)落在30CFU/皿以下時(shí)，儀器法的準(zhǔn)確性欠佳，RSD大于10%，這可能是菌落與培養(yǎng)基的顏色較為接近，或者培養(yǎng)皿上有氣泡且顏色與菌落差異不大時(shí)造成的誤判，或者皿內(nèi)存在的水霧甚至小水珠也會(huì)影響計(jì)數(shù)儀的識(shí)別效果。對兩種計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行配對T檢測分析，可知在95%置信區(qū)間內(nèi)，P值大于0.05，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。
3.2精密度驗(yàn)證
隨機(jī)選取10個(gè)不同批次的醫(yī)用口罩（滅菌型），添加適宜濃度的菌懸液，采用儀器法對測試結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)，見表2。
表2菌落計(jì)數(shù)的精密度驗(yàn)證
由表2可知，兩種計(jì)數(shù)方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，其中儀器法的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%，目測法的平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.81%，儀器法的精密度整體上高于目測法。另外，對于部分樣品，存在儀器法的計(jì)數(shù)結(jié)果稍大于目測法，這主要是由于部分平皿上特別小的菌落，肉眼因看不清而未計(jì)數(shù)，而全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀可放大后再計(jì)數(shù)。
3.3重現(xiàn)性驗(yàn)證
不同試驗(yàn)人員分別采用兩種計(jì)數(shù)方法對同一個(gè)平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差來評價(jià)兩種計(jì)數(shù)方法的重現(xiàn)性，見表3。由表3可知，不同人員采用兩種方法對菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，符合重現(xiàn)性要求。
表3兩種計(jì)數(shù)方法的重現(xiàn)性驗(yàn)證
通過不同試驗(yàn)人員對全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀（圖1）進(jìn)行操作，可知儀器操作相對簡便，圖像采集過程中無需調(diào)節(jié)光度，系統(tǒng)能自動(dòng)調(diào)整使其照出最佳效果；根據(jù)實(shí)際需求可選擇4個(gè)皿或6個(gè)皿一鍵計(jì)數(shù)，選擇適宜的待測組別即可進(jìn)行讀數(shù)；計(jì)數(shù)過程中可人為增加或刪除菌落個(gè)數(shù)進(jìn)行人工修正，有樣本稀釋度輸入、報(bào)告輸出等功能。
圖1全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀的外觀圖
4、結(jié)論與討論
本研究主要探究了不同計(jì)數(shù)范圍的菌落計(jì)數(shù)，通過對目測法和儀器法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行分析，在95%置信區(qū)間P值均大于0.05，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異，其精密度試驗(yàn)和重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果均在10%以內(nèi)。全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀在操作過程中，對大部分菌落能自動(dòng)計(jì)數(shù)，極少部分需要人為識(shí)別進(jìn)行增加、刪除或切割，或者當(dāng)樣品對培養(yǎng)基背景具有干擾時(shí)，也需要人為識(shí)別，進(jìn)而完善計(jì)數(shù)效果；整體上來說，對于正常的無背景干擾的菌落計(jì)數(shù)，儀器計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度和精密度均較優(yōu)，計(jì)數(shù)速度快，且儀器操作簡便、功能齊全實(shí)用，能直接保存計(jì)數(shù)結(jié)果和平皿圖片，利于后期查看。在日常紡織產(chǎn)品檢測中，全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀的使用可有效減少試驗(yàn)人員的工作負(fù)擔(dān)，確保試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可追溯性。今后，還需要不斷完善儀器功能，為試驗(yàn)研究提供更高端、更高質(zhì)量的服務(wù)。
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