柯薩奇病毒B組4型疫苗候選株篩選與研發(fā)
柯薩奇病毒B組4型(Coxsackievirus B4，CVB4)是一種能夠引起腦炎、急性弛緩性麻痹和心肌炎等嚴(yán)重疾病的腸道病毒，并且還被認(rèn)為與Ⅰ型糖尿病密切相關(guān)。近年來，國內(nèi)外CVB4的檢出率不斷升高，已成為一個重要病原體。其致病機(jī)理尚不明確，也沒有針對CVB4的抗病毒藥物和疫苗上市。本研究對CVB4代表株的基因型、全基因組序列、一步生長曲線、遺傳穩(wěn)定性和乳鼠致病性等因素進(jìn)行初步研究，篩選出一株CVB4的疫苗候選株，并對其免疫原性進(jìn)行評價，為CVB4的防控提供參考和CVB4的疫苗研發(fā)提供實驗數(shù)據(jù)。
方法
1.對課題組前期分離到的28株CVB4分離株使用Vero細(xì)胞進(jìn)行傳代適應(yīng)培養(yǎng)。
2.提取CVB4分離株的病毒RNA，并對VP1序列進(jìn)行測序，根據(jù)VP1序列進(jìn)行基因分型，并對能在Vero細(xì)胞上適應(yīng)的4株CVB4分離株進(jìn)行全基因組序列分析。
3.對Vero細(xì)胞適應(yīng)株(136、138、140和141)進(jìn)行蝕斑純化，并將毒株傳代至第五代，使用微量細(xì)胞病變法測定滴度，選擇滴度較高的CVB4毒株進(jìn)行后續(xù)實驗。
4.將毒株傳代至第15代，對P1、P5、P10和P15代病毒進(jìn)行全基因組測序，分析毒株的遺傳穩(wěn)定性。
5.選擇P5代的毒株，使用CVB4分離株進(jìn)行乳鼠致病性實驗，選擇3.5、4.5和5.5lgCCID50三個劑量進(jìn)行乳鼠攻毒實驗，并根據(jù)乳鼠的臨床評分、病理變化、免疫組化和病毒載量結(jié)果，探究毒株致病性。
6.選擇滴度高且遺傳穩(wěn)定性較好的140毒株，測定病毒株的一步生長曲線，制備滅活疫苗，使用BALB/c小鼠評估其免疫原性。并檢測血清交叉保護(hù)能力和母傳抗體的保護(hù)性。
結(jié)果
1.本研究分離到的28株CVB4分離株均位于D基因型中，是中國流行基因型。獲得4株在Vero細(xì)胞上適應(yīng)良好的CVB4分離株，4株能在Vero細(xì)胞上適應(yīng)的CVB4分離株的全基因組序列和中國流行株0316的核苷酸和氨基酸同源性為92.83%～93.42%和98.26%～98.53%;和其他中國流行株的核苷酸和氨基酸同源性為80.87%～81.53%和96.52%～97.11%;和其他國外流行株的核苷酸和氨基酸同源性為80.65%～93.38%和95.92%～97.57%。
2.對4株CVB4毒株蝕斑純化后傳代至第5代，測定滴度，140和141毒株的滴度達(dá)到7.25lgCCID50/mL，136和138毒株滴度為6.25lgCCID50/mL。
3.140毒株相比于141毒株具有更好的遺傳穩(wěn)定性，突變位點較少且VP1區(qū)段沒有發(fā)生突變。
4.140和141毒株均引起腦部、肝臟和肺部嚴(yán)重的病理改變，免疫組化結(jié)果表明這些組織中有明顯的抗原分布，并且腦部和肝臟的病毒載量高于其他組織，肺部的病毒載量也處在較高水平。5.51gCCID50劑量的141毒株實驗組中小腸、胰腺和心臟出現(xiàn)明顯的病理變化，小腸、胰腺和心臟組織可見抗原分布。
5.一步生長曲線結(jié)果顯示，MOI=1時，140毒株病毒拷貝數(shù)在3～18小時內(nèi)快速增加;在18～24小時，病毒拷貝數(shù)緩慢增加;在24～30小時出現(xiàn)平臺期。
6.140毒株制備滅活疫苗，20μg組在3免后21天的中和抗體效價達(dá)到1:2048，該疫苗誘導(dǎo)的中和抗體對136、138、141和A155毒株具有較好的交叉保護(hù)作用，誘導(dǎo)的母傳抗體可以保護(hù)乳鼠在致死劑量攻毒下全部存活，未見明顯癥狀。
結(jié)論
1.本研究中得到4株Vero細(xì)胞上適應(yīng)較佳的CVB4分離株，4株分離株位于基因型D，是中國大陸流行基因型。
2.CVB4毒株對腦部、肝臟和肺部具有較強(qiáng)的組織嗜性。
3.本研究成功篩選到一株滴度高、遺傳穩(wěn)定性好且免疫原性較好的CVB4疫苗候選株140毒株。
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