重組?口蹄疫病毒鑒定、生長特性測定及滅活疫苗制備（一）
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是侵害豬、牛和羊等重大動(dòng)物的烈性傳染病。該病傳播迅速、傳染性極強(qiáng)、發(fā)病率極高，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,WOAH)將其列為必報(bào)動(dòng)物疫病，我國將其列為一類動(dòng)物傳染病之首。FMD的暴發(fā)和流行嚴(yán)重影響發(fā)病地區(qū)的畜牧業(yè)生產(chǎn)，阻礙社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，制約健康養(yǎng)殖，是全球畜牧業(yè)生產(chǎn)急需解決的重大動(dòng)物疫病之一。
口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)屬小RNA病毒科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)成員。FMDV粒子由結(jié)構(gòu)蛋白VP4、VP2、VP3和VP1各60分子組成的二十面體衣殼與單股正鏈RNA組成，其中結(jié)構(gòu)蛋白VP4位于衣殼的內(nèi)部，VP2、VP3和VP1位于衣殼的外部。O型FMDV粒子表面至少含有5個(gè)抗原位點(diǎn)：VP2和VP3各有1個(gè)抗原位點(diǎn)(位點(diǎn)2和4)，VP1含有3個(gè)抗原位點(diǎn)(位點(diǎn)1、3和5)，這些抗原位點(diǎn)是誘導(dǎo)保護(hù)性抗體產(chǎn)生的主要免疫原。其中位于VP1蛋白130?160位氨基酸的G-H環(huán)是誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體最主要的抗原表位，在疫苗免疫保護(hù)應(yīng)答中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。因此，F(xiàn)MDV G-H環(huán)一直是表位疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗研究的熱門靶點(diǎn)。
我國是FMD流行的國家，其中O型FMD流行最廣，也最難防控。目前我國流行的O型FMDV主要分為3個(gè)拓?fù)湫停汗诺渲袊?Cathay)、中東-南亞型(Middle East-South Asia,ME-SA)和東南亞型(South-East Asia,SEA)。O型多拓?fù)湫筒《局旯餐餍屑觿×薋MDV的變異，導(dǎo)致新變異毒株不斷出現(xiàn)，使現(xiàn)用疫苗與流行毒株的抗原匹配性下降或抗原不匹配，容易導(dǎo)致免疫失敗而引發(fā)新疫情的流行，給我國FMD防控提出了前所未有的挑戰(zhàn)。因此，迫切需要篩選高效、廣譜的FMD疫苗候選毒株。
為了發(fā)展能更好地防控當(dāng)前流行的O型3個(gè)拓?fù)湫虵MD流行株，本研究借助FMDV的反向遺傳操作技術(shù)，在已建立含2個(gè)拓?fù)湫?Cathay+SEA)FMDV結(jié)構(gòu)蛋白基因全長克隆基礎(chǔ)上，將ME-SA拓?fù)湫鸵呙缰闓-H抗原表位基因替換其對等基因，構(gòu)建含3個(gè)拓?fù)湫虵MDV結(jié)構(gòu)蛋白基因的重組全長克隆，拯救重組FMDV，研究其作為豬疫苗候選株的潛力。
1材料與方法
1.1質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒
FMDV疫苗株O/HN/CHA/93(Cathay拓?fù)湫?全長感染性克隆嵌合當(dāng)前流行毒株O/NXYCh/CHA/2018(SEA拓?fù)湫?VP1基因的全長質(zhì)粒pOFS/NXVP1和半長質(zhì)粒pSK-Z123/NXVP1均為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所構(gòu)建保存。表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR/T7細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞均為本實(shí)驗(yàn)室保存。FMDV O/GXCX/CHA/2018(MH791316.1)、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017(MF461724.1)、O/NXYCh/CHA/2018(MH791315.1)均由國家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室分離保存。
1.2主要試劑
瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA片段回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、大腸桿菌(Escherichia coli)JM109感受態(tài)細(xì)胞、高保真DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶(BglⅡ、SpeⅠ、NotⅠ、PstⅠ)，寶生物工程(大連)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM 2000、MEM培養(yǎng)基、2×MEM培養(yǎng)基，Invitrogen公司；RNA提取試劑盒，QIAGEN公司；滅活劑二乙烯亞胺(2-bromoethylamine hydrobromide,BEI)，Sigma-Aldrich公司。
1.3 G-H基因替換重組FMDV全長質(zhì)粒的構(gòu)建
以pSK-Z123/NXVP1為骨架，替換FMDV疫苗株O/TUR/5/2009(KP202878.1，ME-SA拓?fù)湫?長約30個(gè)氨基酸G-H環(huán)基因的半長質(zhì)粒pSK-Z123/NXVP1/TURG-H，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。pSK-Z123/NXVP1/TURG-H和嵌合全長質(zhì)粒pOFS/NXVP1經(jīng)SpeⅠ和BglⅡ雙酶切后分別回收約5 400 bp(pSK-Z123/NXVP1/TURG-H)和2個(gè)大小均接近3 000 bp(pOFS/NXVP1)的DNA片段，然后用T4 DNA連接酶連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組全長質(zhì)粒pOFS/NXVP1/TURG-H。全長質(zhì)粒用PstⅠ進(jìn)行酶切鑒定，將符合預(yù)期的質(zhì)粒送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。重組質(zhì)粒含F(xiàn)MDV的基因組示意見圖1A，G-H環(huán)氨基酸差異見圖1B。
圖1重組FMDV構(gòu)建方案示意圖
A：重組FMDV基因組質(zhì)粒全長示意圖.B：重組VP1結(jié)構(gòu)蛋白G-H環(huán)氨基酸的比對
1.4重組FMDV的拯救
重組質(zhì)粒pOFS/NXVP1/TURG-H經(jīng)NotⅠ內(nèi)切酶37℃消化3 h后，用DNA片段回收試劑盒回收，具體步驟參照試劑盒說明書。取2μg回收的pOFS/NXVP1/TURG-H線性化DNA片段用LipofectamineTM 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至80%?90%BSR/T7細(xì)胞，并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染4?5 h后，每孔加1 mL的MEM培養(yǎng)基。每隔12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)，當(dāng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathogenic effect,CPE)后，將其反復(fù)凍融后的上清液接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行傳代，子代病毒用于后續(xù)試驗(yàn)。
1.5重組FMDV的鑒定
1.5.1 RT-PCR和序列測定
取轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，用RNA提取試劑盒提取總RNA，通過一步法RT-PCR試劑盒擴(kuò)增病毒VP1蛋白基因?；厥?、純化目標(biāo)PCR產(chǎn)物后送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。PCR擴(kuò)增和測序引物為VP1-F(5′-AGATAACA CAGGGAAAGCC-3′)和VP1-R(5′-CTGATGGC CTTCACTCCAGT-3′)。
1.5.2間接免疫熒光試驗(yàn)(immunofluorescence assay,IFA)
將轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清和親本病毒分別接種70%?80%滿單層BHK-21細(xì)胞。37℃孵育6 h后細(xì)胞用4%多聚甲醛4℃固定20 min，PBS漂洗3次；用Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗滌3次；加入小鼠抗FMDV 3A單抗(1:200倍稀釋)，37℃孵育1 h，PBS洗3次；加入二抗(山羊抗小鼠IgG-FITC稀釋比例為1:400)，37℃作用1 h，洗去游離二抗后用熒光顯微鏡觀察結(jié)果并保存圖片。
1.6重組FMDV噬斑表型鑒定和生長特性測定
將10倍比系列稀釋的第6代重組FMDV和親本病毒各200μL/孔，分別接種培養(yǎng)于6孔板的BHK-21細(xì)胞，放在37℃條件下孵育，每10 min輕輕搖動(dòng)1次，1 h后加入2 mL黃芪膠混合液(1份2×MEM，1份1.2%黃芪膠)。細(xì)胞靜置培養(yǎng)48 h后，加入固定液(甲醇:丙酮=1:1，體積比)固定30 min，經(jīng)0.1%結(jié)晶紫37℃染色2 h后進(jìn)行噬斑計(jì)數(shù)和噬斑直徑測量，并計(jì)算病毒噬斑形成單位(PFU/mL)。
將第6代重組FMDV和親本病毒的病毒滴度稀釋至5×106 PFU/mL，分別接種BHK-21細(xì)胞置于37℃孵育1 h。棄去未結(jié)合病毒液，補(bǔ)加5 mL MEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每隔4 h收取樣品至16 h，凍融樣品后通過噬斑形成單位測定不同時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度(PFU/mL)并評價(jià)其一步生長特性。
1.7滅活疫苗的制備
取第6代親本病毒和重組病毒各100 mL，反復(fù)凍融2?3次，4℃、6 000 r/min離心30 min，去除細(xì)胞碎片。收集的病毒液分別加入5 mmol BEI于28℃滅活30 h。滅活后的病毒接種BHK-21細(xì)胞進(jìn)行安全性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格的病毒抗原按照常規(guī)方法純化、濃縮后，按抗原:佐劑等體積比配制疫苗(146S抗原終濃度為6μg/mL)，疫苗制品置于4?8℃保存?zhèn)溆谩?
1.8豬的免疫
篩選FMDV結(jié)構(gòu)蛋白/非結(jié)構(gòu)蛋白抗體陰性的3月齡健康仔豬共計(jì)12頭，隨機(jī)分為2組，每組6頭，分別接種親本病毒疫苗和重組病毒疫苗，接種劑量為2 mL/頭份。免疫28 d后采血，分離血清，?20℃保存?zhèn)溆谩?
1.9病毒中和試驗(yàn)
取免疫后28 d的免疫血清進(jìn)行微量病毒中和試驗(yàn)檢測針對3個(gè)拓?fù)湫偷?個(gè)譜系FMDV株(O/GXCX/CHA/2018、O/HB/HK/99、O/XJ/CHA/2017和O/NXYCh/CHA/2018)的交叉中和抗體水平。微量病毒中和試驗(yàn)操作如下：免疫血清在96孔板中進(jìn)行2倍比連續(xù)梯度稀釋；加入50μL病毒稀釋液[滴度為200半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(tissue culture infective dose,TCID50)/0.1 mL]，同時(shí)設(shè)置病毒回歸對照(100 TCID50、10 TCID50、1 TCID50、0.1 TCID50)和細(xì)胞對照。待測血清和病毒稀釋液混勻后，37℃孵育1 h，加入100μL濃度約為1×106個(gè)/mL的BHK-21細(xì)胞懸液。培養(yǎng)72 h后觀察CPE，按Karber法計(jì)算血清中和抗體滴度。
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