利用CIRBP作為胰腺癌診斷及治療分子標記物（細胞增殖生長曲線檢測步驟）
RIP技術(RNABindingProteinImmunoprecipitation，RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀)，是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結(jié)合情況的技術。運用針對目標蛋白的抗體把相應的RNA-蛋白復合物沉淀下來，然后經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復合物上的RNA進行分析；即用抗體或表位標記物捕獲細胞核內(nèi)或細胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白，防止非特異性的RNA的結(jié)合，免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA一起分離出來，結(jié)合的RNA序列通過microarray(RIP-Chip)，定量RT-PCR或高通量測序(RIP-Seq)方法來鑒定；目標蛋白是一種應激反應蛋白，在應激反應過程中，可以從細胞核遷移到細胞質(zhì)，此外，目標蛋白還可以從細胞中分泌出來，在細胞外作為損傷相關分子模式發(fā)揮功能，促進炎癥反應，并在急性和慢性炎癥中發(fā)揮重要作用。
一種利用CIRBP作為胰腺癌診斷及治療分子標記物的方法，所述方法步驟包括如下：
步驟1：材料準備，準備試劑細胞培養(yǎng)試劑：胎牛血清，DMEM-高糖培養(yǎng)基，RPMI-1640培養(yǎng)基，青鏈霉素，PBS磷酸鉀緩沖液，Trypsin-EDTA(0.25％)phenol red以及實驗耗材6孔板細胞培養(yǎng)板，12孔板細胞培養(yǎng)板，24孔板細胞培養(yǎng)板，48孔板細胞培養(yǎng)板，96孔板細胞培養(yǎng)板，巴氏吸管；
步驟2：細胞復蘇，將水浴鍋預熱至37℃，用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面，在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等，取出凍存管，迅速解凍，迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，在凍存管內(nèi)還存在一點點沒融化的時候，取出，用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)，制備細胞懸液，將細胞轉(zhuǎn)移至一個15ml離心管內(nèi)，一滴一滴地加入預熱好的培養(yǎng)基，同時一邊晃動離心管；加入培養(yǎng)基的量要達到10ml以上，離心，在低速離心機上，以800rpm離心5分鐘；吸去上清，然后用1ml培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液分裝入培養(yǎng)皿內(nèi)，將培養(yǎng)皿放入37℃含CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，換液的時間由細胞沉降速度情況而定；
步驟3：細胞培養(yǎng)，將水浴鍋預熱至37℃，用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面，在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等，取出細胞培養(yǎng)瓶，無菌操作，打開瓶蓋，吸掉舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞一至二次，加入trypsin-EDTA溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，輕洗細胞皿底部，吸掉trypsin-EDTA溶液，放入37℃培養(yǎng)箱2-3分鐘，輕拍培養(yǎng)瓶壁使大部分細胞脫落，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現(xiàn)圓粒狀時，加入適量含血清之新鮮培養(yǎng)基終止trypsin作用；
步驟4：實驗分組，檢測項目為RIP檢測CIRBP調(diào)控TP53、、PCR檢測CIRBP、TP53、wb、CIRBP、ACSL4、PTGS2、NOX1、GPX4、FTH1、普魯士藍染色、激光共聚焦檢測線粒體活性氧ROS、谷胱甘肽GSH檢測、流式凋亡檢測、細胞增殖生長曲線檢測；
步驟4中細胞增殖生長曲線檢測步驟為a：取各處理組細胞進行下面實驗；b：消化細胞后吹打散細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×105個/ml，分到96孔板，每孔100ul，即每孔細胞為1×104個；c：貼壁細胞需待細胞貼壁后，再收集各時間點細胞進行檢測；d：收集各個時間點的細胞(0h，24h，48h，72h)加入CCK-8溶液(碧云天，Cat.No.C0037)，比例為1/10。即100ul培養(yǎng)液加入10ul檢測液；e：在孵育4小時后，酶標儀讀板，CCK-8檢測讀取OD450數(shù)據(jù)。
步驟5：RIP檢測P CIRBP調(diào)控TP53。
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