釀造產(chǎn)香魯氏接合酵母耐溫、耐鹽的營(yíng)養(yǎng)需求特點(diǎn)與逆境響應(yīng)差異
魯氏接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）是一種重要的產(chǎn)香食品酵母，在醬油釀造中發(fā)揮著重要作用，也是食品腐敗微生物之一。長(zhǎng)期以來(lái)，魯氏接合酵母具備兩種截然相反的特點(diǎn)，對(duì)高濃度鹽的高耐受性和對(duì)高溫的高敏感性。該酵母的耐鹽機(jī)理備受研究者的關(guān)注，明確了高鹽下酵母細(xì)胞的生理變化特點(diǎn)，篩選和鑒定出一系列耐鹽相關(guān)基因和蛋白。然而，魯氏接合酵母耐溫、耐鹽特性差異研究較少，影響了雙重抗性優(yōu)良菌株的構(gòu)建。
湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院的劉夢(mèng)奇、閆珍珍、李欣*等針對(duì)釀造產(chǎn)香魯氏接合酵母，確定了全合成最少營(yíng)養(yǎng)組分的培養(yǎng)基，基于此探索酵母細(xì)胞在長(zhǎng)時(shí)期（120 h）的高鹽（18%NaCl）和高溫（40℃）脅迫下對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求特點(diǎn)，并進(jìn)一步研究從適應(yīng)期到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的有機(jī)酸代謝、氨基酸代謝、胞內(nèi)相容抗逆物質(zhì)和重要逆境響應(yīng)調(diào)控基因表達(dá)等方面的兩種逆境響應(yīng)差異。
建立全合成最低營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基
為了規(guī)避逆境非必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)代謝分析和基因表達(dá)分析的干擾，同時(shí)也為尋找逆境必須營(yíng)養(yǎng)物提供干凈的背景，以YNB為對(duì)照培養(yǎng)基和出發(fā)培養(yǎng)基，選取酵母最適葡萄糖為唯一碳源，以脯氨酸為唯一氮源，采用單因素遞減策略對(duì)微量元素進(jìn)行評(píng)估，建立魯氏接合酵母最低營(yíng)養(yǎng)需求的全合成培養(yǎng)基。魯氏接合酵母在全合成培養(yǎng)基中及其不同逆境下的生長(zhǎng)曲線如圖1A所示。
魯氏接合酵母2013310在YNB培養(yǎng)基培養(yǎng)120 h的最大OD600nm達(dá)到31.01±0.72，而在全合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h最大OD600nm只有14.22±1.23。同時(shí)，該酵母在全合成培養(yǎng)基的高溫和高鹽逆境下培養(yǎng)120 h的最大OD600nm只有2.44±0.13和3.87±0.12。此外，與YNB培養(yǎng)基相似，酵母細(xì)胞在全合成培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線也顯示出清晰的適應(yīng)期（0～12 h）、增殖期（12～84 h）和穩(wěn)定期（84～120 h）。由此可見，全合成培養(yǎng)基能滿足魯氏接合酵母在正常生理環(huán)境下的生長(zhǎng)增殖需求。魯氏接合酵母在高鹽逆境下需要大約36 h適應(yīng)環(huán)境，而在高溫環(huán)境下的適應(yīng)期只有大約2 h。同時(shí)，在48 h時(shí)，高鹽逆境下的魯氏接合酵母進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期，而高溫下的酵母細(xì)胞在4 h已經(jīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)前期?？梢?，該酵母對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)能力比高鹽逆境好。鑒于魯氏接合酵母在兩種逆境下的不同生長(zhǎng)曲線，高溫逆境前12 h和高鹽逆境前48 h（適應(yīng)期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期）被用來(lái)研究魯氏接合酵母對(duì)兩種逆境的響應(yīng)差異。
通過掃描電鏡觀察魯氏接合酵母2013310在全合成培養(yǎng)基及不同逆境下的形態(tài)學(xué)差異（圖1B）。在全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)下，魯氏接合酵母菌體主要呈圓形的單細(xì)胞狀態(tài)（與正常狀態(tài)下酵母形態(tài)一致），部分表面有褶皺，有明顯的出芽現(xiàn)象。發(fā)酵24 h后菌體全部呈圓形或橢圓形，表面圓潤(rùn)飽滿，光滑無(wú)褶皺。在高鹽條件下，酵母在48 h對(duì)數(shù)前期細(xì)胞縮小，表面出現(xiàn)嚴(yán)重的褶皺變化，大部分呈單細(xì)胞存在。在高溫條件下的酵母在發(fā)酵8 h后，細(xì)胞大小較全合成培養(yǎng)基0 h較為接近，但存在部分細(xì)胞表面出現(xiàn)褶皺，且分布似乎有絮凝的趨勢(shì)，這可能與高溫對(duì)酵母細(xì)胞壁蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)影響有關(guān)。高鹽脅迫比高溫脅迫對(duì)全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下酵母細(xì)胞形態(tài)影響更為顯著；而相對(duì)于高溫逆境，該酵母在高鹽條件展現(xiàn)出更高的生長(zhǎng)活性。
魯氏接合酵母逆境條件下的營(yíng)養(yǎng)需求差異
酵母細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取只有兩條途徑，自身合成或轉(zhuǎn)運(yùn)外源營(yíng)養(yǎng)物。微生物基因表達(dá)和代謝在逆境下會(huì)發(fā)生劇烈變化，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物的需求應(yīng)該會(huì)發(fā)生相應(yīng)的調(diào)整?？紤]到高溫逆境和高鹽逆境可能會(huì)關(guān)閉某些營(yíng)養(yǎng)物的自身合成途徑，使得酵母細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物獲取的方式發(fā)生變化，因此，分析全合成培養(yǎng)基中8種有機(jī)酸、7種維生素、7種核苷類物質(zhì)和14種氨基酸對(duì)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，將有助于闡明魯氏接合酵母在面對(duì)高溫逆境和高鹽逆境時(shí)的營(yíng)養(yǎng)需求差異。
高鹽逆境下的魯氏接合酵母2013310的生長(zhǎng)不需要額外有機(jī)酸，但丙酮酸和草酰乙酸卻能促進(jìn)高溫逆境下酵母細(xì)胞的增殖，較對(duì)照分別提高了34.5%和24.2%（。無(wú)論是高鹽還是高溫逆境，魯氏接合酵母2013310對(duì)丙酸和正丁酸敏感。這兩種有機(jī)酸幾乎完全抑制了高鹽逆境下酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)。高溫逆境下，添加丙酸、正丁酸的魯氏接合酵母2013310 OD600nm較對(duì)照（OD600nm＝2.81）分別降低了85.1%、74.0%。高鹽逆境下，不同類型維生素對(duì)魯氏接合酵母高鹽脅迫下生長(zhǎng)無(wú)顯著效果；高溫逆境下，維生素的添加，在整體上促進(jìn)了菌體生長(zhǎng)，其中添加硫胺素菌體OD600nm較對(duì)照（OD600nm＝2.51）提高了1.47倍。不同類型核苷酸在兩種條件下對(duì)魯氏接合酵母2013310生長(zhǎng)均無(wú)顯著影響。
氨基酸的添加對(duì)高鹽和高溫脅迫下的魯氏接合酵母2013310生長(zhǎng)有明顯影響。高鹽逆境下，蛋氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、色氨酸均能緩解菌體所受高鹽脅迫，OD600nm較對(duì)照分別提高2.72、3.40、2.73倍和2.42倍；高溫逆境下，能緩解細(xì)胞所受脅迫的氨基酸有賴氨酸、谷氨酰胺、色氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、亮氨酸和精氨酸，其OD600nm較對(duì)照分別提高52.0%、31.1%、49.2%、34.5%、66.2%、19.4%和57.1%。絲氨酸和半胱氨酸均并不利于魯氏接合酵母2013310耐受高鹽和高溫脅迫。
總體而言，遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細(xì)胞更需要外源氨基酸，而補(bǔ)充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細(xì)胞的高溫壓力。這些結(jié)果也表明，魯氏接合酵母的維生素和氨基酸自我合成代謝被高溫壓力所抑制。同時(shí)，谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸是魯氏接合酵母細(xì)胞在兩種環(huán)境壓力下均需要的氨基酸。纈氨酸和蛋氨酸是魯氏接合酵母細(xì)胞在高鹽壓力下生長(zhǎng)所需的獨(dú)特氨基酸，而賴氨酸、天冬酰胺和精氨酸是高溫壓力下魯氏接合酵母細(xì)胞所需的獨(dú)特氨基酸。由于氨基酸是蛋白質(zhì)的重要組成單位，蛋白質(zhì)又參與酶的形成、物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)等，這表明有必要從蛋白層面進(jìn)一步研究魯氏接合酵母對(duì)高鹽和高溫壓力響應(yīng)的機(jī)理。
高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母胞內(nèi)外代謝物差異
有機(jī)酸具有多重生理功能，也參與了生命體核心代謝途徑，如丙酮酸溢流代謝和三羧酸循環(huán)。在選取的6種被檢測(cè)有機(jī)酸物質(zhì)中，兩種逆境下的魯氏接合酵母2013310細(xì)胞的胞內(nèi)均只有乙酸被檢測(cè)到，而且變化過程相似。乙酸在細(xì)胞生長(zhǎng)適應(yīng)前期（高鹽的12 h，高溫的2 h）在細(xì)胞內(nèi)大量積累，最高含量分別達(dá)到（78.60±3.23）μg/g（細(xì)胞干質(zhì)量，下同）和（126.30±10.56）μg/g。在隨后的12 h（高鹽）或2 h（高溫），胞內(nèi)乙酸水平大幅下降，分別降為（19.54±3.56）μg/g（高鹽，24 h）和（38.30±7.02）μg/g（高溫，4 h）。此后，乙酸含量幾乎維持穩(wěn)定。
在高鹽逆境下也只檢測(cè)到單一的胞外有機(jī)酸乙酸。乙酸在生長(zhǎng)前期（0～12 h）快速積累并在12 h達(dá)到峰值（（364.09±15.65）μg/L），24 h后乙酸被快速消耗至（117.09±17.01）μg/L（36 h）。在高溫下，除了乙酸，胞外還存在多種有機(jī)酸，包括正丁醇、丙酮、丙酸、丁酸和異丁酸。除乙酸外，5種有機(jī)酸在培養(yǎng)的前2 h就完成了胞外的積累。乙酸在胞外持續(xù)積累，最大質(zhì)量濃度達(dá)到（566.32±13.76）mg/L（10 h）。乙偶姻是一種酮類物質(zhì)，是魯氏接合酵母在胞外積累的第二大化合物。乙酸代謝可能在魯氏接合酵母長(zhǎng)期適應(yīng)高溫高鹽壓力中起著重要的作用，是有機(jī)酸代謝的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。推測(cè)乙酸的存在有利于乙酰輔酶A的合成，因?yàn)橐阴］o酶A是一種重要的抗逆中間代謝物。同時(shí)，考慮到全合成培養(yǎng)基的特點(diǎn)，胞外有機(jī)酸的出現(xiàn)源于胞內(nèi)有機(jī)酸代謝及其分泌。相比于高鹽壓力，糖代謝在高溫壓力下更活躍。可見，魯氏接合酵母針對(duì)高鹽和高溫逆境采用了不同的有機(jī)酸代謝策略。無(wú)論是高鹽還是高溫脅迫，魯氏接合酵母均不會(huì)在胞內(nèi)積累有機(jī)酸，這應(yīng)該是避免有機(jī)酸的傷害，與前面營(yíng)養(yǎng)需求研究結(jié)果一致。
高鹽和高溫脅迫下魯氏接合酵母抗逆代謝物的差異
微生物合成抗逆代謝產(chǎn)物來(lái)抵御環(huán)境壓力是一種重要的壓力響應(yīng)機(jī)制。魯氏接合酵母胞內(nèi)糖代謝對(duì)高鹽和高溫逆境產(chǎn)生了兩種截然不同的響應(yīng)。高鹽逆境下的魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)只有鼠李糖和半乳糖。在適應(yīng)初期的12 h，酵母細(xì)胞大量積累鼠李糖，而半乳糖在胞內(nèi)只有少量增加，但二者在24 h下降。進(jìn)入細(xì)胞生長(zhǎng)期時(shí)，這兩種糖的胞內(nèi)濃度顯著上升。與之不同，高溫逆境下魯氏接合酵母胞內(nèi)存在葡萄糖、海藻糖、木糖醇和甘油。傳統(tǒng)上的抗逆保護(hù)劑（海藻糖和甘油）在魯氏接合酵母胞內(nèi)只有極少量的積累，最大含量分別為（369.00±21.01）μg/g和（268.10±21.18）μg/g（8 h），而木糖醇水平卻顯著上升（（1 788.20±100.56）μg/g，8 h）。這表明對(duì)魯氏接合酵母2013310而言，木糖醇，而非海藻糖和甘油，是其高溫壓力下的抗逆保護(hù)劑。然而，本研究結(jié)果表明，高鹽壓力下的魯氏接合酵母細(xì)胞內(nèi)沒有葡萄糖。這可能是兩個(gè)因素導(dǎo)致的：其一，高鹽下的魯氏接合酵母對(duì)外源葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力不強(qiáng)，導(dǎo)致胞內(nèi)葡萄糖濃度處于檢測(cè)線之下；其二，對(duì)高鹽環(huán)境下的魯氏接合酵母而言，葡萄糖可能并不是最適碳源，胞內(nèi)葡萄糖被快速轉(zhuǎn)化成其他糖類物質(zhì)。全合成培養(yǎng)基中添加木糖醇、海藻糖、甘油對(duì)魯氏接合酵母在高鹽環(huán)境下的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，相比空白對(duì)照，OD600nm分別提高了115.4%、217.0%、223.9%（數(shù)據(jù)未顯示）。
結(jié)論
溫度壓力和鹽壓力是魯氏接合酵母在醬油高鹽固態(tài)發(fā)酵過程中遭遇的主要逆境。與其他環(huán)境壓力不同，微生物對(duì)這兩種逆境無(wú)法通過采用降解壓力因子的方式緩解。本研究基于低營(yíng)養(yǎng)全合成培養(yǎng)基，在營(yíng)養(yǎng)、代謝和轉(zhuǎn)錄3個(gè)層面分析了魯氏接合酵母2013310從生長(zhǎng)適應(yīng)期到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的高鹽和高溫逆境響應(yīng)?？傮w而言，該酵母采用了不同的策略來(lái)適應(yīng)高溫和高鹽逆境。遭遇高鹽壓力的魯氏接合酵母細(xì)胞更需要外源氨基酸，而補(bǔ)充維生素和氨基酸有助于緩解酵母細(xì)胞的高溫壓力。谷氨酰胺、色氨酸、酪氨酸和乙酸代謝對(duì)酵母細(xì)胞適應(yīng)高溫和高鹽逆境極其重要。本研究加深了對(duì)耐鹽魯氏接合酵母耐溫機(jī)制的理解。同時(shí)，微生物不同抗性之間存在交互作用。魯氏接合酵母耐高鹽的特性與對(duì)溫度的高敏感性之間的關(guān)聯(lián)性有待研究，這將有助于為雙抗逆新型魯氏接合酵母細(xì)胞株的構(gòu)建提供方向和著力點(diǎn)。
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