基于ELISA和細(xì)菌生長曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測腸炎沙門氏菌（一）
沙門氏菌屬(salmonella)是一大群寄生于人類和動物腸道內(nèi)，生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相似的革蘭氏陰性桿菌［1，2］。據(jù)統(tǒng)計在世界各國的種類細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。國內(nèi)外對食品中沙門氏菌的檢測技術(shù)或檢測方法研究并不鮮見［3-5］。這些方法大都都是對沙門氏菌的定性檢測但是對沙門氏菌定量研究很少。目前，僅有SN/T0040-1992是沙門氏菌定量方法，原理是基于MPN法實現(xiàn)定量。SN/T0040-1992雖然可以定量檢測但是缺點操作繁瑣，需要稀釋三個梯度或更多，每個梯度3管共9管，每個管都要進行陰陽性判斷才能確定，耗時費力，同時，該方法由于從225 ml 10倍樣品稀釋液中取1 ml用來增菌培養(yǎng)存在漏檢風(fēng)險。本課題以腸炎沙門氏菌為例對沙門氏菌定量研究模型進行探討，基于ELISA和細(xì)菌生長曲線應(yīng)用的結(jié)合，研究沙門氏菌的定量，開發(fā)一種一種操作簡單有效能夠?qū)悠分猩抽T氏菌本底含量檢測的方法。
1材料與方法
1.1材料與儀器
1.1.1實驗儀器:MiniVidas酶聯(lián)免疫分析儀制造商生物梅里埃，恒溫培養(yǎng)箱型號INE600制造商MEMMERT。
1.1.2培養(yǎng)基:緩沖蛋白胨水(BP)海博生物批號20120509，亞硒酸鹽胱氨酸增菌液(SC)海博生物批號20120506，四硫磺酸鹽煌綠增菌液(TTB)海博生物批號20120309，亞硫酸鉍瓊脂(BS)海博生物批號20120417，DHL瓊脂海博生物批號20120315，3M菌落總數(shù)測試片規(guī)格型號PertrifilimTM 6406批號2013-10TP。
1.1.3菌株:腸炎沙門氏菌株(salmonella enteritidis)3代，大腸桿菌(escherichia coli)3代(購置中國工業(yè)菌種保藏中心)，奇異變形菌(P.mirabilis)2代(實驗室分離獲得)
1.2方法
1.2.1標(biāo)準(zhǔn)菌株活化:以無菌操作將菌株濾紙片放入10 mm緩沖蛋白凍水試管中，36℃培養(yǎng)過夜;培養(yǎng)液劃線接種平板BS，DHL培養(yǎng)24～48 h;挑去單菌落接種到盛有20 ml BPW的試管中培養(yǎng)18 h備用。
1.2.2菌液的梯度稀釋及計數(shù):10倍梯度稀釋菌液(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8)，分別將10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液1 ml接種測試片，每個梯度接種2片，放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)24～48 h后計數(shù)。
1.2.3酶聯(lián)免疫分析儀測試值(熒光值)與沙門氏菌濃度函數(shù)關(guān)系建立:腸炎沙門氏菌株純化后挑去單菌落接種于緩沖蛋白胨水中10～20 ml 36℃培養(yǎng)12～18 h，分別進行10倍稀釋，5倍稀釋，4倍稀釋3倍稀釋和2倍稀釋。選取2、3、4、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1 000倍稀釋液使用Vidas檢測，同時使用3M細(xì)菌菌落計數(shù)測試片對培養(yǎng)液10-5，10-6，10-7進行計數(shù)。然后建立Vidas測試值與沙門氏菌濃度(取對數(shù)值)數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系式。
1.2.4沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線繪制:使用不同濃度沙門氏菌分別接種TTB(1、10、50、150、380 cfu/ml)、SC(0.58、5.8、20、58、200、580 cfu/ml)增菌液100 ml于42℃和36℃培養(yǎng)間隔1或2 h取樣，使用測試片對沙門氏菌計數(shù)，培養(yǎng)至16～20 h。繪制不同接種濃度沙門氏菌在兩種培養(yǎng)液中的生長曲線。
1.2.5生長曲線對人為污染樣品的檢測:選用樣品常溫和冷鮮豬和雞肉25 g進行人為污染，放入25 ml增菌液均質(zhì)1 min，然后加入剩下的200 ml增菌液置于36℃和42℃培養(yǎng)，分析建立的方法對人為污染樣本檢出的的誤差。
1.2.6干擾試驗:選擇大腸桿菌，金黃色葡萄球菌，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，變形桿菌作為干擾菌。設(shè)置兩組相同的樣品，第1組如同驗證試驗部分，只添加一定濃度的腸炎沙門氏菌到樣品中，第2組在第1組的基礎(chǔ)上添加干擾菌混合液包括大腸埃希菌，金黃色葡萄球菌，單增李斯特氏菌和變形桿菌，每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗證試驗部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對增菌液檢測。每種干擾菌的添加量均是目標(biāo)菌10倍以上。操作同驗證試驗部分，在SC增菌液中增菌10 h，使用vidas對增菌液檢測。
基于ELISA和細(xì)菌生長曲線應(yīng)用的結(jié)合定量檢測腸炎沙門氏菌（一）
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