食品接觸表面的微生物污染長(zhǎng)期存在，如何篩選出代表性抗菌化合物的消毒劑
與食品接觸的表面上存在細(xì)菌污染是食品加工業(yè)中一個(gè)長(zhǎng)期存在的問(wèn)題。乳制品和海產(chǎn)品加工裝置中存在單核細(xì)胞增生李斯特菌，肉類(lèi)、乳制品和海產(chǎn)品加工裝置中存在金黃色葡萄球菌，堅(jiān)果和堅(jiān)果相關(guān)產(chǎn)品加工單元中存在腸沙門(mén)氏菌，牛肉加工表面存在大腸桿菌。
法國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查表明，大約60%的食源性疾病與加工過(guò)程中病原體從受污染的設(shè)備轉(zhuǎn)移到食品有關(guān)。消毒劑和消毒劑的傳統(tǒng)測(cè)試通常使用AOAC使用稀釋法來(lái)監(jiān)測(cè)處理過(guò)的細(xì)菌的生長(zhǎng)/不生長(zhǎng)，或者通過(guò)計(jì)算細(xì)胞的微生物對(duì)數(shù)減少來(lái)計(jì)算，這涉及到計(jì)數(shù)后存活的細(xì)菌細(xì)胞治療。這兩種方法都是耗時(shí)且勞動(dòng)密集型的，oCelloScope微生物動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)是一種自動(dòng)明場(chǎng)光學(xué)顯微鏡，已用于監(jiān)測(cè)對(duì)多種細(xì)菌的抗菌敏感性。oCelloScope的光軸與水平面成6.25°角傾斜，從而可以準(zhǔn)確成像多孔板中液體培養(yǎng)基中高濃度和低濃度的細(xì)菌細(xì)胞。在每個(gè)讀取點(diǎn)以z堆棧的形式獲取多個(gè)圖像，其中包含聚焦圖像和逐漸失焦的圖像。盡管oCelloScope主要是明場(chǎng)，但傾斜技術(shù)的存在可以生成一些相位對(duì)比信息。oCelloScope軟件具有多種算法，可用于分析收集的數(shù)據(jù)。
細(xì)菌生長(zhǎng)曲線由oCelloScope軟件通過(guò)測(cè)量隨時(shí)間從z堆棧收集的像素來(lái)生成。本研究旨在開(kāi)發(fā)一種快速篩選抗菌劑以對(duì)抗表面的植物性細(xì)菌病原體的方法。被選為代表性抗菌化合物的消毒劑廣泛用于食品加工行業(yè)。使用oCelloScope數(shù)據(jù)來(lái)計(jì)算用NaOCl和BAC（苯扎氯銨）作為消毒劑處理后微量滴定板中干燥細(xì)菌細(xì)胞的微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)。將該數(shù)據(jù)與在不銹鋼和幸存者上進(jìn)行類(lèi)似處理的細(xì)菌細(xì)胞的MLR進(jìn)行比較通過(guò)電鍍回收。結(jié)果表明oCelloScope可用作快速確定溶解性抗菌化合物MLR的工具。
丹麥Biosense微生物生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用
使用oCelloScope分析粉狀細(xì)菌的生長(zhǎng)，將細(xì)菌在75%RH的96孔板的孔內(nèi)。20小時(shí)后，將200μL TSB添加到孔中，并使用oCelloScope隨時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)菌細(xì)胞。為了使用oCelloScope分析非干燥微生物的生長(zhǎng)，腸炎沙門(mén)氏菌的過(guò)夜培養(yǎng)物在TSB中以250 rpm的速度在搖床上生長(zhǎng)。隨后，將104–105 CFU/孔的接種物添加到96孔板的孔中，然后添加TSB并監(jiān)測(cè)細(xì)菌數(shù)。用于分析抗菌藥物敏感性，對(duì)微量滴定板中的干燥細(xì)胞進(jìn)行抗菌處理。將每種濃度的NaOCl或BAC 50微升(50μL)添加到孔中（每種濃度一式三份）并孵育30秒、1分鐘、3分鐘或5分鐘。處理后，加入200μL TSB+0.1%硫代硫酸鈉或TSB+0.7%卵磷脂在oCelloScope中監(jiān)測(cè)細(xì)胞數(shù)量之前，分別加入孔中以中和NaOCl和BAC。將每個(gè)多孔板(96孔)置于oCelloScope內(nèi)進(jìn)行分析。圖像通過(guò)重復(fù)獲取，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集10幅圖像。照明時(shí)間為2 m秒，像距固定為4.9μm。每2小時(shí)采集一次圖像，持續(xù)24小時(shí)或每30分鐘采集一次，持續(xù)4小時(shí)。選擇軟件UniExplorer上的背景校正吸收（BCA）算法和BCA歸一化算法進(jìn)行分析。BCA算法利用所有z堆棧圖像數(shù)據(jù)，校正背景光強(qiáng)度，然后將圖像分為背景和對(duì)象像素。BCA算法提供了基于光吸收的準(zhǔn)確細(xì)胞數(shù)數(shù)據(jù)，尤其是在細(xì)菌密度低的情況下。BCA歸一化值是通過(guò)從生長(zhǎng)曲線上后續(xù)圖像的BCA值中減去第一張圖像的BCA值來(lái)計(jì)算的。分析了最佳焦點(diǎn)圖像以及z-stack視頻，以觀察細(xì)菌細(xì)胞因抗菌化合物而發(fā)生的任何形態(tài)變化。
實(shí)驗(yàn)結(jié)論:
oCelloScope可用于有效監(jiān)測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)并生成細(xì)菌生長(zhǎng)曲線。觀察到粉狀的腸炎沙門(mén)氏菌細(xì)胞的生長(zhǎng)可以在干燥后24小時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而細(xì)胞活力沒(méi)有發(fā)生重大變化。觀察到的腸炎沙門(mén)氏菌S型生長(zhǎng)曲線與傳統(tǒng)上通過(guò)光密度分析觀察到的結(jié)果一致。oCelloScope可用作量化抗菌劑功效的快速篩選方法。由于平板計(jì)數(shù)測(cè)定通常需要數(shù)天時(shí)間來(lái)量化抗菌化合物對(duì)病原體的影響，因此oCelloScope有可能節(jié)省寶貴的時(shí)間和精力。此外，使用oCelloScope進(jìn)行分析所需的一次性用品明顯少于用于標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)的一次性用品。這有助于降低實(shí)驗(yàn)室成本和產(chǎn)生的廢物量，使其更加環(huán)保。研究證明oCelloScope可用于量化MLR和細(xì)菌生長(zhǎng)的各種參數(shù)。它可用于分析溶解性抗菌化合物對(duì)細(xì)菌的功效，并可快速篩選食品行業(yè)中獨(dú)特的消毒配方。本文討論的方法可以在未來(lái)開(kāi)發(fā)有效的抗菌化合物以改善衛(wèi)生和全球食品安全方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
圖1、(A)添加TSB后干燥腸炎沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)，使用oCelloScope測(cè)量并在24小時(shí)內(nèi)量化（●）。使用背景校正吸收(BCA)算法分析生長(zhǎng)。歸一化值是根據(jù)初始時(shí)間點(diǎn)(0 h)的BCA值計(jì)算的。不含腸炎沙門(mén)氏菌的TSB用作陰性對(duì)照（□）（B）oCelloScope圖像顯示TSB中腸炎沙門(mén)氏菌的細(xì)菌數(shù)量隨時(shí)間增加。明場(chǎng)圖像表明細(xì)菌的數(shù)量逐漸增加，直到大約16小時(shí)，之后細(xì)菌密度太高，BCA算法無(wú)法計(jì)算。
圖2、使用oCelloScope監(jiān)測(cè)NaOCl處理后存活的腸炎沙門(mén)氏菌細(xì)胞的生長(zhǎng)。用不同濃度的NaOCl處理微量滴定板中的細(xì)菌5分鐘，然后加入TSB+0.1%硫代硫酸鈉，并使用oCelloScope在室溫下監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)24小時(shí)。使用(A)標(biāo)準(zhǔn)化BCA算法和(B)BCA（無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化）算法繪制微生物的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。用不含氯（●）、20 ppm游離氯（△）、50 ppm游離氯（■）或100 ppm游離氯（○）的溶液處理腸炎細(xì)胞。BCA圖（虛線框，B）零時(shí)間的數(shù)據(jù)點(diǎn)用于計(jì)算BCA減少。(C)oCelloScope圖像在用0、20、50或100 ppm游離氯處理后在零時(shí)間獲得的細(xì)菌的數(shù)量。
圖3、在NaOCl處理30秒、1分鐘、3分鐘和5分鐘后，使用BCA算法（灰色條）與傳統(tǒng)MLR量化測(cè)定（平板計(jì)數(shù)，白色條）比較微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)。在用100 ppm游離氯處理粉狀的腸炎沙門(mén)氏菌(A)、大腸桿菌O157:H7(B)和單核細(xì)胞增生李斯特菌(C)細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)MLR進(jìn)行量化。相對(duì)于未處理的粉狀細(xì)菌的陰性對(duì)照計(jì)算對(duì)數(shù)減少（使用零時(shí)間的數(shù)據(jù)點(diǎn)）。使用雙向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)于每張圖，不同的字母在統(tǒng)計(jì)上是不同的。
圖4、在BAC處理30秒、1分鐘、3分鐘和5分鐘后，使用BCA算法（灰色條）與傳統(tǒng)MLR量化測(cè)定（白色條）比較微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)。在用100 ppm BAC處理粉狀的腸炎沙門(mén)氏菌(A)和大腸桿菌O157:H7(B)和20 ppm BAC處理粉狀的單核細(xì)胞增生李斯特菌(C)細(xì)菌后，對(duì)MLR進(jìn)行量化。相對(duì)于未處理的粉狀細(xì)菌的陰性對(duì)照計(jì)算對(duì)數(shù)減少（使用零時(shí)間的數(shù)據(jù)點(diǎn)）。使用雙向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
圖5、在存在或不存在姜黃素的情況下照射后大腸桿菌O157:H7的微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)。(A)使用oCelloScope測(cè)量處理后存活的大腸桿菌O157:H7的生長(zhǎng)。大腸桿菌O157:H7未經(jīng)處理（無(wú)輻照或姜黃素，●）、無(wú)姜黃素輻照（■）、1μM姜黃素?zé)o輻照（△）和在1μM姜黃素存在下輻照（○）。(B)使用或不使用姜黃素(1μM)照射后，使用BCA算法（灰色條）與傳統(tǒng)MLR量化測(cè)定（白色條）比較微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)。相對(duì)于未處理的陰性對(duì)照計(jì)算對(duì)數(shù)減少。使用雙向方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析
總結(jié)
食品加工行業(yè)中食品接觸表面的微生物污染是一個(gè)重大的健康危害。評(píng)估食品加工過(guò)程中使用的消毒劑的功效對(duì)于確保公眾健康和安全至關(guān)重要。本研究描述了一種使用oCelloScope量化抗菌處理后存活細(xì)菌細(xì)胞數(shù)量的光學(xué)篩選方法，以微生物對(duì)數(shù)減少(MLR)表示。研究人員測(cè)試了兩種消毒劑次氯酸鈉和苯扎氯銨對(duì)三種病原體（腸炎沙門(mén)氏菌、大腸桿菌O157:H7和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌）的干燥細(xì)菌的功效食品加工表面上令人擔(dān)憂的問(wèn)題。不銹鋼載玻片用于模擬商業(yè)食品加工表面。在對(duì)不銹鋼表面進(jìn)行抗菌處理之前，將細(xì)菌細(xì)胞在75%的相對(duì)濕度(RH)下干燥，并通過(guò)平板計(jì)數(shù)分析存活水平以計(jì)算MLR。這些與使用oCelloScope生成的MLR值進(jìn)行了比較，使用oCelloScope分析MLR，將細(xì)胞在75%RH的聚苯乙烯微量滴定板上干燥，用抗菌劑處理，并分析存活的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果表明，使用oCelloScope的BCA算法計(jì)算的處理過(guò)的干燥細(xì)胞的MLR值與使用傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)測(cè)定法生成的值相當(dāng)，抗菌劑針對(duì)所有測(cè)試病原體的濃度和處理時(shí)間相同，這說(shuō)明該方法可用于快速篩選溶解性抗菌化合物的MLR。oCelloScope可用作量化抗菌劑功效的快速篩選方法。由于平板計(jì)數(shù)測(cè)定通常需要數(shù)天時(shí)間來(lái)量化抗菌化合物對(duì)病原體的影響，因此oCelloScope有可能節(jié)省寶貴的時(shí)間和精力。此外，使用oCelloScope進(jìn)行分析所需的一次性用品明顯少于用于標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)的一次性用品。這有助于降低實(shí)驗(yàn)室成本和產(chǎn)生的廢物量，使其更加環(huán)保。
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